赛默飞PCR常见故障维修步骤说明

赛默飞PCR常见故障维修:常规PCR?老实说,没有这样的事情。即使是***简单的 PCR 反应也可能出错,因此您需要有一个好的想法清单,用于 PCR 故障排除和纠正问题。今天,我集思广益,想出了解决标准 PCR 反应问题的所有方法。我不可避免地错过了一些东西,所以如果你能想到要添加的其他东西,请补充。我会将您的想法添加到列表中,使其成为我们都可以参考的资源。
赛默飞PCR常见故障维修步骤说明
赛默飞PCR无放大故障维修
1. 再试一次反应,你可能遗漏了一些东西。
2. 检查聚合酶缓冲液是否已完全解冻并充分混合。
3. 检查引物是否稀释到正确的浓度。
4. 配制新的 dNTP 溶液。dNTPs 可以被反复冻融破坏。
5. 重新制作模板 DNA,尤其是在处理基因组 DNA 时。旧库存可能会退化或被剪掉。
6. 使用不同的聚合酶。如果使用校对聚合酶进行扩增有问题,我经常尝试使用良好的旧 Taq,这通常可以解决问题。不过请记住对插入片段进行排序——如果幸运的话,不会有任何重大突变,您可以按原样使用插入片段。否则,使用 Taq 和 1/10 浓度的校对酶的混合物重新进行 PCR,您仍应获得相同的扩增,但错误率较低。
7. 改变退火温度。如果退火温度太高,您显然不会按照您想要的顺序进行任何启动。另一方面,太低的退火温度会导致这种非特异性引发,不允许出现特定条带。找到***佳温度的***佳方法是使用梯度循环仪并以 1ºC 的增量测试从***低引物 Tm 到低于 10ºC 的范围。
8. 尝试不同模板浓度的反应。您的模板浓度可能太低或制备中的杂质浓度可能太高。在 50 微升反应中尝试 5-10 次平行反应,浓度为 10 到 200 ng。
9. 检查 PCR 仪——温度和时间是否符合您的预期?
10. 在另一台循环仪中尝试反应——您使用的循环仪的校准可能已关闭。
11.尝试添加剂。我发现 DMSO 在有问题的扩增中特别有用。
12.重新设计引物——尽量遵守指南。
赛默飞PCR非特异性带扩增故障维修
13. 用阴性对照(无模板)重新进行反应。非特异性条带可能是由于外源 DNA(可能是您的!)污染了您的一种股票。如果这是一个问题,请使用新库存,始终使用高压灭菌的 PCR 小瓶并戴上手套和实验室外套。
14. 提高退火温度。更好的是,使用梯度 PCR 机器(参见 7。)
15. 重新设计引物并使 3' 更长。额外的条带可能来自与您的目标相似的序列。增加引物长度将使它们更适合您的目标。
16. 如果非特定产品比您的目标短,则增加退火时间。如果它们比您的目标长,请减少退火时间。
17.使用较少的DNA模板。
18. 尝试接触式 PCR。
赛默飞PCR目标的弱放大故障维修
19.降低退火温度。
20. 增加退火时间。
21. 增加引物、模板和/或聚合酶的浓度。
22. 尝试接触式 PCR。
23.增加循环次数。
24.尝试添加剂。
25. 清理分离的靶标,并将其用作新反应的模板。