ABI PCR常见故障维修

ABI PCR常见故障维修:实时聚合酶链反应 (PCR) 是一种极其敏感的检测方法,其中***轻微的变化都会影响结果。因此,要进行一致且高效的ABI PCR 检测,必须首先优化或考虑几个参数。
以下是获得可重现ABI PCR 结果的三个常见问题和解决方案:
1. 问题:结果不一致
一种。一致的细胞生长:由于ABI PCR 检测的可靠性和灵敏度,该检测已被用作广泛应用的***方法,包括分子诊断、基因分型和基因表达研究。对于后一种分析,细胞或样品的健康状况会对结果的可变性或再现ABI PCR常见故障维修
产生巨大影响。因此,如果细胞生长条件导致细胞应激或生长不一致,基因表达的模式和时间会因实验而异。保持持续生长的一种方法是使用优质组织培养器皿,例如我们的 TPP 培养皿和盘子。我们的 TPP 产品系列由***高纯度的塑料制成,并经过创新建模以改进一致和可重复数据的生成。这些菜肴提供更平坦、更一致的生长表面,温度分布均匀,并通过堆叠通风口减少蒸发。试用一个样品并亲眼看看。
湾 蒸发问题:确保您的板或管正确密封以防止蒸发非常重要。如果发生蒸发,来自报告染料的信号将由于信号浓度的增加而增加,这将影响测定结果。根据蒸发的程度,您可能会得到可用的结果,但在不同的检测中会有差异。如果您遇到蒸发,这里有一些方法可以将其***小化:确保正确的盖子或密封膜与正确的板和管配对,(2) 确保密封正确覆盖所有孔,包括蒸发的板边缘***常发生,并且 (3) 使用滚筒或直边将粘合剂盖完全密封到板上。查看我们的库存并找到合适的ABI PCR和 PCR 密封膜满足您的PCR需求。
C。使用优质化学品和耗材:由于检测的敏感性,反应组成或移液中***轻微的错误都会影响***终结果。正是出于这个原因,大多数使用即用型反应预混液来***大程度地减少移液步骤、层流清洁工作台、校准移液器和低结合屏障吸头来制备样品的数量。***好使用低结合塑料制品(PCR管、试条和吸头),以***大限度地减少样品损失并提高样品和实验的一致性。此外,使用屏障***和超净工作台减少了污染的机会。
2. 问题:无信号或低信号
一种。使用优质 DNA 模板:古老的格言垃圾进垃圾出适用。这就是为什么包含几个控制反应作为每个反应的质量控制检查的原因。确保使用高质量的 DNA 提取和逆转录试剂盒进行干净的样品制备,不含任何ABI PCR抑制剂。不完全的核酸纯化会留下痕量的物质,这些物质会抑制或干扰ABI PCR反应。
湾 使用经过验证的引物和探针序列:有多种在线工具可以帮助评估引物和探针的特性。请务必查看文献(和 RTPrimerDB 数据库)以获取已验证或已发布的探针和引物序列。在选择目标序列时,请务必遵循***佳实践,例如避免使用具有二级结构、单核苷酸重复区域 (>4) 和高 GC 含量区域的区域;目的是扩增一个短区域(75-200bp),因为短序列的扩增效率更高,但足够长,使产物与任何引物二聚体形成区分开来。
C。调整仪器的检测灵敏度:每台仪器都有特定的灵敏度和动态范围。一些仪器可以检测低至基因的一个拷贝,而其他仪器则不那么敏感。灵敏度也会影响信噪比(特异性杂交荧光信号与非特异性杂交事件的比率),其中比率越高,仪器的灵敏度越高。因此,如果您在 PCR 分析中没有看到任何峰,则可能是阈值设置得太高,其中较低的峰信号被视为噪声。
3. 问题:量化错误
一种。数据分析:虽然ABI PCR 分析具有高灵敏度(具有广泛的定量动态范围)和重现性,但重要的是要有适当的控制来准确分析和解释结果。定量变异可能由多种来源引起,例如 DNA 质量、反应效率、酶抑制和许多其他因素。正是出于这个原因,采用内部对照来比较感兴趣基因的表达与另一种基因表达的关系。
湾 使用参考染料:如果您的仪器允许,请使用参考染料,例如 ROX 染料,以补偿孔间的任何差异。因为在ABI PCR反应过程中参考染料浓度是恒定的,所以所有孔的染料信号应该相同。尽管没有必要使用参考染料,但请确保您知道您的仪器如何补偿孔间差异。
ABI PCR常见故障维修总结:***后,如果您在进行ABI PCR 分析或计划开始一个项目时遇到困难,请让 MIDSCI 帮助您为您的特定热循环仪、管和板、密封膜和屏障提示选择正确的 PCR 酶,以获得成功和可重复的结果。